MERKEZ LABORATUVARI


İzotermal Titrasyon Mikrokalorimetresi

Cihaz: VP-ITC MicroCal

İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) bağlayıcı bir bileşenin eklenmesiyle başlatılan bir kimyasal reaksiyonun gözlenmesi için kullanılan termodinamik bir tekniktir. ITC biyomoleküler etkileşimlerin karakterizasyonu için tercih edilen bir metottur. Maddeler bağlandığında ısı açığa çıkar veya absorbe edilir.

Bu ısının ölçülmesi

  • bağlanma katsayısı (Kb)
  • reaksiyon sitokiometrisi (n)
  • entalpi (DH) ve
  • entropi (DS) değerlerinin

doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar.

ITC'de ligand çözeltisi içeren bir şırınga makromolekül çözeltisi içeren bir hücre içine sabit sıcaklıkta titre edilir. Ligand hücre içine enjekte edildiğinde iki madde birbirini etkiler ve ısı bağlanmayla doğru orantılı olarak serbest kalır veya absorbe olur. Hücre içindeki makromolekül liganda doymuş hale geldiğinde, sadece gerideki seyrelme ısısı gözlenene dek ısı sinyali azalır.

VP-ITC sistemi örnek ve referans hücre arasında üretilen ve absorbe edilen ısının farka dayalı ölçümü için hücre geribildirim ağı kullanan son derece hassas bir izotermal titrasyon kalorimetredir. Termoelektrik cihaz iki hücre arasındaki sıcaklık farkını ölçmekte ve ikinci bir cihaz da hücreler ve kapak arasındaki sıcaklık farkını ölçmektedir. Örnek hücresi içinde kimyasal reaksiyonlar meydana geldiğinde ısı oluşturulur veya absorbe edilir. Örnek ve referans hücreler arasındaki sıcaklık farkı (ΔT1) örnek veya referans hücreye uygun şekilde ısı eklenmesiyle geribildirim sistemi kullanılarak sıfırlanır. Belirli sürede ΔT1= 0 eşitliğini sağlamak için gereken gücün integrali çalışılan prosesten çıkan toplam ısının ölçüsünü verir. Şekil1'de ITC hücreleri ve şırıngası gösterilmiştir.

Özellikler

  • Az bakımla yenilenebilir son derece hassas performans için yerinde sabitlenmiş hücreler
  • Aktif hücre hacmi ~ 1.3 ml
  • Üstün kimyasal dirençlilik özelliklerine sahip Hastelloy®'den üretilmiş hücreler
  • 250 mikrolitrelik hassasiyete sahip şırınga içeren doğrusal sıkışlı sıvı dağıtım sistemi
  • Değişken karıştırma hızı
  • Sıcaklık aralığı 2ºC- 80ºC
  • Dahili Peltier mekanizması - dıştan ısıtma veya soğutma gereksinimi yok
  • <102 to ~109 M-1 aralığında bağlanma sabitlerinin doğrudan ölçümü
  • Kompetitif bağlanma teknikleri kullanılarak sıkı bağlanma sabitlerinin (109 M-1'den büyük) ölçümü

Şekil 1 -  ITC hücreleri ve şırıngası. Şırınga ITC deneyi boyunca yerinde döner. Şırınganın ucu ITC hücresi içinde sürekli karıştırmayı sağlamak için adapte edilmiştir. Pompa bilgisayar kontrollüdür ve ligand hacimlerini doğru şekilde enjekte eder.

Örnek Özellikleri

Hücre için makromolekül (protein, lipit vb.) içeren 2.5 ml çözelti gerekmektedir. Hücre çalışma hacmi 1. 4 ml'dir. Ligand içeren otomatik pipet enjeksiyon hacmi (µl) genelde 3 ve 15 µl arasındadır. Toplam enjeksiyon sayısı deney tasarımı ve konsantrasyon ayarı ile belirlenmektedir. Bulanık ve renkli çözeltiler ve tanecikli süspansiyonlar kullanılabilir. Kimyasal etiketleme veya bağlanan bileşiklerin immobilizasyonu gerekmemektedir.

Uygulamalar

  • protein-küçük molekül etkileşimleri
  • protein-karbohidrat etkileşimleri
  • protein-lipit etkileşimleri
  • lipit & lipit- küçük molekül etkileşimleri
  • nükleik asit- küçük molekül etkileşimleri
  • nükleik asit- lipit etkileşimleri
  • protein-nükleik asit etkileşimleri
  • nükleik asit-nükleik asit etkileşimleri
  • antibadi çalışmaları
  • reseptör etkileşimleri
  • biyolojik olmayan etkileşimler (küçük molekül-küçük molekül etkileşimleri)
  • enzim kinetiği